Lesbian •

Kromosom obalans sex

2021-05-04T18:22:54
Add Comment
sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

kvinnor stora naturliga bröst
sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

sex kromosom obalans

Denna artikel beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för preimplantatorisk genetisk diagnostik PGD i en klinisk miljö. Preimplantatorisk genetisk diagnostik PGD är ett etablerat alternativ till fosterdiagnostik, och innebär att välja pre-implantation embryon från en kohort som genereras av assisterad befruktning teknik ART.

Detta urval kan krävas på grund av familjär monogena sjukdomar t. Oocyter aspirerat efter ovulationsstimulering befruktas av in vitro-nedsänkning i sperma IVF eller intracytoplasmatisk injektion av en enskild spermie ICSI. Preimplantatorisk klyvning steg embryon biopsier, vanligen genom att ta bort en enda cell på dag 3 efter befruktning, och biopsier cellen testas för att fastställa den genetiska statusen av embryot.

Fluorescens in situ hybridisering FISH på den fasta kärnan av biopsier celler med mål-specifika DNA-prober är den teknik val för att upptäcka kromosom obalans i samband med kromosom omorganiseringar, och att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom som det inte finns ingen mutation-specifika test. FISK har också använts för att screena embryon för spontana kromosom aneuploidi även känd som PGS och PGD-AS i syfte att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning, men beskrev det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH tekniken här sannolikt är oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning.

Vi beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för PGD i en klinisk miljö. Analys med en fluorescensmikroskop Utrustad Lämpligt med lämpliga filter för den använda prober.

Metafas och interfasen kärnor från odlade perifera lymfocyter i blod bör undersökas för att bekräfta att de valda sonder är specifika för translokation kromosomerna, informativ för brytpunkter den subtelomere sonder ska hybridisera endast flyttad segment och centromer sond s till centrerad segment s och de signaler i interfas kärnor ska vara ljusa och diskreta.

Poängsättning antalet signaler för varje givare i interfas kärnor från varje deltagande rekommenderas att bedöma effektiviteten i analysen. Figur 1 visar en metafas och interfasen kärnan från en förberedelse för en ömsesidig translokation mellan korta armar av kromosomer 5 och 9.

Signaler i interfas kärnor från embryo blastomerer bör vara ljusa och diskreta och värderade med hjälp av olika filter bandpass för de färger som används.

Figur 2 visar en blastomere kärna med en normal signalmönster 2 exemplar för alla testade loci förenlig med en normal eller balanserad kromosom komplement till kromosom 5 och 9, och en kärna med en avvikande signal mönster som överensstämmer med en obalanserad produkt av translokation som har monosomi en kopia för flyttad segment av kromosom 5 och trisomi 3 kopior för flyttad segment av kromosom 9.

Figur 1 En metafas spridning och en interfasen kärna som framställts av odlade perifera lymfocyter i blod från en bärare av en ömsesidig translokation mellan korta armar av kromosomer 5 och 9 med brytpunkter vid 5p FISK sonder valdes ut för både flyttad segmenten 5p Figur 2.

Signaler i interfas blastomere kärnor från dag-3 embryon som tagits med en annan filter för varje fluorokrom och slås samman till en sammansatt bild. A Två signaler för varje givare visar två kopior av varje locus, vilket är förenligt med en normal eller balanserat komplement för translokation kromosomerna. B En röd signal, tre gröna signaler och två blå signaler om ett exemplar av flyttad segment av kromosom 5, tre kopior av flyttad segment av kromosom 9 och två kopior av centrerad segment av kromosom 9, vilket stämmer överens med angränsande -1 segregation av translokationen resulterar i en obalanserad med monosomi för 5p Tillämpningen av fluorescens in situ hybridisering FISH till en enda embryo cell blastomere presenterar speciella utmaningar både i praktiska och i tolkningen av signalen mönster.

Den biopsier cellen måste spridas inom en på förhand definierat område i bilden, för att underlätta dess lokalisering följande fiskarter; extrem försiktighet måste vidtas för att säkerställa att cellen är lyserade, att cytoplasman har skingrats, och att kärnan är synlig och intakt, och som diagnosen beror på resultaten från denna enda cell, stränga poängsättning och tolkning riktlinjer bör tillämpas.

Principen om PGD av fisk är att mål-specifika DNA-prober märkta med olika fluorokromer eller haptener kan användas för att detektera kopian antal specifika loci, och på så sätt att upptäcka kromosom obalans i samband med meiotiska segregering av kromosom omdisponeringar 1 , inklusive Robertsonian translokationer, ömsesidiga translokationer, inversioner och komplexa omflyttningar 2.

Fisk kan också användas för att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom för vilken det inte finns någon mutation-specifika tester 3, 4. Mer kontroversiellt är FISH också använts för att screena för sporadiska kromosom aneuploidi för att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning 5, 6 , men det är det prediktiva värdet av detta test med hjälp av FSIH sannolikt oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning 7.

Denna artikel koncentrerar sig på tekniska aspekter och de begränsningar som FISH tillämpas på klinisk encelliga diagnos. Metoden bör vara lämpligt valideras för laboratoriet Denna metod kan användas för att förbereda enstaka kärnor för FISH diagnostik av könsbestämning och omorganiseringar kromosom med acceptabla diagnostiska noggrannheten 7.

Probe mixar kan kombinera direkt märkta och indirekt märkta prober, och sonder från olika tillverkare. Sonder för kända polymorfa kromosomområden 11, 12 , eller de kända för att över hybridisera signifikant med andra kromosomer 13 bör undvikas, men kan användas om visat sig vara specifik och lämplig för PGD av tidigare tester på både reproduktiv partner.

En sond som innehåller tre prober, specifikt för centromer regioner i X-och Y-kromosomer och en autosome, rekommenderas för könsbestämning 14 , den autosomal sonden används för att upprätta ploidi och därmed att skilja mellan trisomi X 2n, 47 , XXX och triploidy 3n , 69, XXX och mellan tetrasomy X 48 , XXXX och tetraploidy 4N , 92, XXXX.

En typisk sond som tillämpas i denna inställning är Abbott AneuVysion blandning som innehåller alfa-satellit-X, Y och 18, denna givare som har visat sig ha en mycket låg polymorfism takt, och därför förbehandling upparbetning av reproduktiv partner krävs inte Sonden blandning för någon speciell ombildning bör helst innehålla sonder åtminstone tillräckligt för att upptäcka alla förväntade produkter av ombildning med kromosom obalans.

Om detta inte är möjligt, blandar sond där oupptäckt obalanserade produkter har bedömts vara icke livskraftiga i en igenkännbar graviditet och har sannolikt mycket låg förekomst kan vara acceptabelt Testas på odlade lymfocyter metafaser från båda reproduktiva partner.

Minst tio metafas sprider bör undersökas för givare specificitet, polymorfismer och cross-hybridisering, och för kromosom ombildning bärare, för att säkerställa att sonder hybridisera som väntat till olika segment av ombildning. Dessutom bör minst interfas kärnor från dessa förberedelser görs för att bedöma signal specificitet, ljusstyrka och discreteness Commercial PGS sond uppsättningar finns tillgängliga t. Abbott MultiVysion PB eller PGT , med inriktning på kromosomerna som oftast visar sig vara aneuploid i produkter av befruktningen, och som består av en ensam sond per kromosom riktade.

Typiskt kärnan kan ha en andra hybridisering med sonder för extra kromosomer ger en assay för kromosomerna 13, 15, 16, 18, 21, 22, och XY Det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH teknik som beskrivs här är sannolikt att oacceptabelt låga i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning 7, Tekniker såsom jämförande genomik hybridisering CGH tillämpas på enstaka celler kan testa för det antal kopior av varje kromosom Wilton et al.

Men upplösningen gränsen och noggrannhet för segmentet obalans fortfarande osäkra och det är troligt att fisk kommer att fortsätta vara den teknik val för kromosom omdisponeringar omfattar små segment.

Scriven, P. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Thank you for your interest in JoVE.

We will get back to you as soon as we can, so please stay tuned. If you need immediate assistance, please email us at support jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Medicine.

Bereda ml och filtrera 20 ml i en 30 ml steril universella behållare med en steril 20 ml spruta och filtrera spruta. Tillsätt 1 ml-portioner i 1,7 ml sterila mikrocentrifugrör, nära och etikett rören före frysning. Det rekommenderas att ha två olika partier är att använda den nya parti och det tidigare partiet, som har testats och kan användas om det nya partiet är otillfredsställande. Frosta av lyseringsbuffert i rumstemperatur 30 minuter före biopsi förfarande.

Av praktiska skäl arbetstemperaturen kommer att vara mellan rumstemperatur och hand temperatur. Betyg en liten cirkel ca 5 mm diameter på undersidan av en amin-belagd slide t. Genetix med en diamant penna och pre-märka bilden med ärendenummer, unika bildnummer, och biopsi datum. Använd en separat bild för varje blastomere i nummerordning och etikett med embryot nummer.

Diabilder bör märkas med en hård penna som 4H, och "utplånas" med en latex handske för att ta bort grafit damm. Placera en liten mängd lyseringsbuffert inom cirkeln. Överför biopsier blastomere i lyseringsbuffert. Om det behövs lägger lyseringsbuffert inom cirkeln tills cellen börjar lysera, cellen ska Lyse helt och cytoplasman skingra innan bufferten torkar.

Observera kärnan för att säkerställa att det förblir inom cirkeln och är inte förlorad, om cellen inte har någon kärna eller har flera kärnor, biopsi annan cell. Lämna bilden för att lufttorka i rumstemperatur. Slå på och ställ in den heta blocket t. Hybaid Omnislide eller Vysis Hybrite till 75 ° C. Defrost sonder, virvel, och centrifugera. Reagensen ska bevittnas och verifieras vara korrekt innan upp sonden blandningen. Pipettera volymer som anges av tillverkaren för att ge sonden blandningen i en 0,65 ml sterilt mikrocentrifugrör och vortexa och centrifugera före användning.

Den totala volymen av probe Blandningen ska vara tillräcklig för att tillåta 2 mikroliter per kärna som ska testas och avrundas uppåt till närmaste 10 mikroliter för att möjliggöra en säkerhetsmarginal.

Skölj objektglasen två gånger i sterilt destillerat vatten. Se till att bilderna är helt nedsänkt och om någon grafit damm flyter upp till ytan, sug upp med en ren vävnad.

Rekord ställning kärnan inom cirkeln genom att visualisera med ett faskontrastmikroskop. Applicera 2 mikroliter av sond blandningen och täck med en 9 x 9 mm täckglas en fjärdedel av en 18 x 18 mm no. Täta kanterna på täckglas med gummi cement t. Cow tandköttet, Cow Proofing. Codenature glasen på en varm kvarter vid 75 ° C i 5 min, och sedan hybridisera bilderna över natten h i en fuktig kammare vid 37 ° C.

Probe mixar som uteslutande består av centromer sonder dvs för könsbunden fall kommer att ge ett tillfredsställande resultat efter 60 minuter av hybridisering. Förbered ett vattenbad med tillräcklig Coplin burkar och värm till 71 ° C.

Förbered en 0. Tillsätt 50 ml av stränga tvätta krävs per Coplin burken och kontrollera att temperaturen är 71 ° C omedelbart före användning med en ren termometer.

Tvätta bilderna i 0. Tvätta inte mer än sex bilder per Coplin burk. Om sonden blandningen innehåller indirekt märkt sond s , dränera diabilder av överflödig vätska och tillämpa 20 mikroliter av fluorescerande antikropp i en 20 x 20 mm torget i Parafilm.

Inkubera i en fuktig kammare vid 37 ° C i 15 min. Tvätta två gånger i 2 minuter i PBS ent rumstemperatur och dränera bilder. Blot och försegla kanterna på täckglas med tydliga nagellack. Betyg signaler genom direkt visualisering med hjälp av en fluorescensmikroskop och ensamstående bandpassfilter för varje fluorokrom i analysen. Varje kärna ska bedömas av två analytiker.

En allmän riktlinje bör leda till poängsättning av en enda signal där två tätt placerade signaler är mindre än en domän signal-bredd isär, men behöver dom baserade på erfarenhet skall utnyttjas för att tolka signaler av varierande storlek, intensitet och separation. Använd mjukvara för bildhantering t. Isis, MetaSystems, Altlussheim, Tyskland, CytoVision, Genetix för att fånga en bild av en grundplåt för bekräftelse av den visuella diagnos, och för bildarkivering som en del av ett laboratorium för kvalitetssäkring plan.

Representativa resultat: Metafas och interfasen kärnor från odlade perifera lymfocyter i blod bör undersökas för att bekräfta att de valda sonder är specifika för translokation kromosomerna, informativ för brytpunkter den subtelomere sonder ska hybridisera endast flyttad segment och centromer sond s till centrerad segment s och de signaler i interfas kärnor ska vara ljusa och diskreta.

Play Video. Cite this Article Scriven, P.

You may also like

0 Comment

Leave a Comment

Privacy Settings
We use cookies to enhance your experience while using our website. If you are using our Services via a browser you can restrict, block or remove cookies through your web browser settings. We also use content and scripts from third parties that may use tracking technologies. You can selectively provide your consent below to allow such third party embeds. For complete information about the cookies we use, data we collect and how we process them, please check our Privacy Policy
Youtube
Consent to display content from Youtube
Vimeo
Consent to display content from Vimeo
Google Maps
Consent to display content from Google
Save